DNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些?就是说做实验的时候!

DNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些?就是说做实验的时候!
DNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些?
就是说做实验的时候!

DNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些?就是说做实验的时候!
DNA的粗提取
①准备材料 将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室,至少24 h.
②取材 称取30 g菜花,去梗取花,切碎.
③研磨 将碎菜花放入研钵中,倒入10 mL研磨液,充分研磨10 min .
④过滤 在漏斗中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液滤入烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心,用1 000r/min的旋转频率,离心25 min,取上清液放入烧杯中).在4 ℃冰箱中放置几分后,再取上清液.
⑤加冷酒精 将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并用玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部).沉淀35 min后,可见白色的DNA絮状物出现.用玻璃棒缓缓旋转,絮状物会缠在玻璃棒上.
(2)DNA的鉴定
①配制二苯胺试剂 取0.1 mL B液,滴入到10 mL A液中,混匀.
②鉴定 取4 mL DNA提取液放入试管中,加入4 mL 二苯胺试剂,混匀后观察溶液颜色(不变蓝).用沸水浴(100 ℃)加热10 min .在加热过程中,随时注意试管中溶液颜色的变化(逐渐出现浅蓝色).
研磨液的配制方法
Tris：10.1 g(相对分子质量为121.14),先加50 mL 蒸馏水溶解,用物质的量浓度为2 moL/L 的盐酸调至pH8.0,再加下述药品.
NaCl：8.76 g(相对分子质量58.44)
EDTA：37.2 g(相对分子质量372.24)
SDS：20 g(相对分子质量288.3)
待上述药品全部溶解后,再用蒸馏水定容至1 000 mL.
若在室温低于20 ℃时配制药液,SDS呈沉淀析出,此时需要加温,才能将SDS溶解.如果提前配制的研磨液出现了沉淀,则应加温使沉淀溶解后再使用.
研磨液中几种药品的作用
SDS(十二烷基磺酸钠):可使蛋白质变性,与DNA分离.
EDTA(乙二胺四乙酸二钠):为DNA酶的抑制剂,可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA.
物质的量浓度为0.15 moL/L的氯化钠溶液：能很好地溶解DNA.
Tris/HCl：提供缓冲体系,DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态.(Tris为三羟甲基氨基甲烷)
鉴定DNA的其他方法 用紫外灯照射法鉴定DNA效果很好.具体鉴定方法如下.
1.配制染色剂.用蒸馏水配制万分之五的溴化乙锭(EB)溶液.
2.将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上,再滴1滴EB溶液染色.
3.将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中),可见橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在280 nm处).

质粒抽提流程详解——沉淀菌体
检查细菌培养情况，将明显浑浊的菌液倒在已经编号的2ml的沉菌用离心管里，在约12000转/min的速度下离心沉淀1分钟，保证无悬浮物后取出；将离心管倒扣在卫生纸上，用力敲击，至液体培养基完全去除；如发现菌体沉淀的少，可多加2ml菌液重复沉菌一次。
在离心管中加入250µl 加过RNaseA1酶的Buffer S1，用振荡器震荡，直到沉淀完全充...

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质粒抽提流程详解——沉淀菌体
检查细菌培养情况，将明显浑浊的菌液倒在已经编号的2ml的沉菌用离心管里，在约12000转/min的速度下离心沉淀1分钟，保证无悬浮物后取出；将离心管倒扣在卫生纸上，用力敲击，至液体培养基完全去除；如发现菌体沉淀的少，可多加2ml菌液重复沉菌一次。
在离心管中加入250µl 加过RNaseA1酶的Buffer S1，用振荡器震荡，直到沉淀完全充分悬浮。
1. Buffer S1是什么？主要组分是什么？
50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0
2. Buffer S1的功能是什么？
50 mM葡萄糖：加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果Buffer S1中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
EDTA ：大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在Buffer S1中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。 ——但是对于测序而言，我们是用水溶解质粒，所以EDTA是必须的。
3.如果抽提质粒恰好Buffer S1用完了，可不可以用水代替？
只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
质粒抽提流程详解——裂解
在离心管中加入250µl Buffer S2，上下缓慢颠倒7~8次至混旋液澄清（这步的操作时间不得超过4分钟）；
☆ 注意：颠倒时不能太剧烈，否则会有核DNA污染；如果Buffer S2因温度过低有SDS沉淀析出，可将其放置55~60C水溶锅中适当加热至澄清后再用。
1.抽提质粒的原理是什么？
碱裂解法
2. Buffer S2是什么？主要组分是什么？
0.2 N NaOH / 1% SDS
SDS：十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS），是洗洁精的主要成分。常用于DNA提取过程中使蛋白质变性后与DNA分开。
3.Buffer S2的功能是什么？
NaOH：NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解。用了不新鲜的NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
4.加入Buffer S2为何时间不能太久，动作要轻柔？
第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
质粒抽提流程详解——中和
加入400ul Buffer S3，剧烈颠倒5~10次，使之充分中和，同时将大块白色沉淀振成小块，便于离心。
在约13600转/min的速度下离心沉淀12分钟，如有因沉淀不完全引起的白色絮状物质，可重复振荡离心直至沉淀完全。
1. Buffer S3是什么？主要组分是什么？
3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸
2.加入Buffer S3后出现的白色沉淀是什么？&3.Buffer S3的功能是什么？
每个人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。
最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，与此同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
2 M的醋酸的作用是什么？
是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。
质粒抽提流程详解——纯化
将上步离心上清液用移液器转移到吸附柱上，在约10500转/min的速度下离心1分钟。
注意：不要把沉淀物转移到吸附柱里，1个样品使用1个枪头。
为何离心上清液经离心后，质粒DNA就被吸附到膜上？
在高盐状态下，硅胶膜专一性地吸附DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。
质粒抽提流程详解——洗涤脱盐
取出DNA吸附柱，弃掉废液收集管中的液体，将柱子放回这个离心管中，加入500ul Wash Solution到柱子中，高速离心（10,000rpm)30秒。
重复上述步骤一次。
取出DNA吸附柱，弃掉废液收集管中的液体，将柱子放回这个离心管中，最大速度离心2分钟
使用Wash Solution要进行两次洗涤，目的是使残留的蛋白、盐离子等杂质更充分的被去除，保证硅胶膜上吸附的DNA尽量纯。
质粒抽提流程详解——产物回收
将DNA吸附柱移入新的1.5ml离心管中，在DNA吸附柱的膜中央加入30-40ul 预热无菌双蒸水，室温放置2分钟后12，000rpm离心1分钟，离心管底即为质粒DNA。

收起

这个步骤要求注意力非常集中，而且是非常关键的一步，必须要形成一个泾渭分明因此，实验中最好使用塑料的烧杯和试管，可以减少提取过程中DNA的损失。②